qPCR原理：qPCR（Real-time Quantitative PCR）即实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR），在PCR过程中加入荧光基团，实时监测扩增产物的变化。通过分析Ct值和标准曲线，对起始模板进行定量分析。实时荧光PCR的产物有三种主要方法：DNA结合染料法、探针化学法、淬灭染料引物法。
与阈值接近的，可不可以算为差异基因； （6） 不使用p调整值，而直接使用p值选择选择差异基因，是否可行； （7） 通常样本重复数在多少是合适的； （8） 为什么有时候qPCR结果和RNA-seq结果中，差异基因表达特征不一致，是RNA-seq不准吗； （9） 常见图表解读，包括散点图、火山图、热图、韦恩图、时间趋势折线图等。
qPCR数据处理方法为△△Ct法原理 【△△Ct法原理】其特点是只依靠Ct值来计算结果，因此跑完qPCR之后的结果中除了Ct值外，其他数据几乎在后续分析和计算中是用不到的。但前提是目的基因和内参基因的扩增效率应基本一致。
根据研究目的和数据的性质选择合适的统计分析方法。常见的分析方法包括描述性统计分析、t检验、方差分析、回归分析等。对于qpcr数据，通常会用到t检验来比较不同样本间的基因表达差异。数据处理与可视化 数据处理包括数据清洗、数据转换和标准化等步骤，以消除实验过程中的误差和偏差。
实时定量PCR（qPCR）是一种精确的DNA扩增分析方法，它通过在每次PCR循环后实时监测荧光信号的积累，来定量分析样品中的目标序列。其原理基于在PCR反应中加入荧光基团，从而能够监控扩增产物的生成。此方法的关键在于Ct值，它代表信号强度达到阈值所需的循环次数，有助于确定模板的起始量。
qPCR绝对定量有两种方法：（1）先获得一个拷贝数已知的参照基因，再获得靶标基因与该参照的比值，然后根据已知值获得检测样本的确切数目，从这个角度看绝对定量就是借助了“拷贝数已知”这一外力的相对定量。1990年，Gilliland等就描述了这一原理。
qPCR主要有两种基本类型：SYBR染料法和TaqMan探针法。SYBR染料法利用SYBR Green I对双链DNA的特异性结合，荧光信号与PCR产物同步增长，但需确保引物的特异性。TaqMan探针法则通过探针分子设计，荧光基团与淬灭基团的结合变化指示扩增，其特异性更高，可同时检测多个基因。
基因表达检测（QPCR）详解QPCR技术基于荧光监测每轮PCR反应后产物总量的实时检测，用于追踪PCR扩增过程。主要检测方法有加尾法和颈环法，其中加尾法适用于miRNA的定量检测，通过RNA加尾和引物延伸，仅需少量样本（1μg）且无需分离miRNA，一次反转录产物可适用于多种miRNA检测，具有高通量和准确性。
qPCR可以用来检测人类或动物体内的病原微生物或疾病相关基因的表达量，如检测病毒、细菌、真菌等的感染情况，以及检测癌症相关基因的表达量，用于辅助疾病的诊断和治疗。qPCR的优点：高灵敏度：qPCR的检测灵敏度非常高，可以检测到极低浓度的核酸，有利于微量样本的检测和分析。
qPCR技术在生物医学、食品、药物研究等领域发挥着重要作用，如疾病诊断（如禽流感、食品安全中的食源微生物检测）、遗传病检测、药物效果评估、肿瘤研究以及食品和动物疫病的监控。在动物疾病检测中，qPCR用于筛查禽流感、口蹄疫等常见病原体，以及炭疽芽孢杆菌等潜在威胁。
1、步骤：组织RNA提取（Trizol法）——RNA浓度测定及反转录——跑PCR——数据处理△△CT 组织RNA提取（Trizol法）每50mg组织使用1ml Trizol匀浆，最大转速瞬离匀浆管。将溶液转移到新的EP管中，室温放置5分钟。加入0.2ml（1/5Trizol）氯仿，剧烈混匀，室温静置5分钟，4℃ 12000g离心15分钟。
2、实验步骤：提取核酸、反转录（RNA样本）、预处理、设计引物和探针、准备反应体系、执行PCR循环、数据分析。qPCR相关问题判断方法讲解 引物设计问题判断：检查扩增曲线、曲线形状、引物设计正确性。使用琼脂电泳检查引物设计效果。RNA提取合格判断：通过紫外风光光度法和电泳法检查RNA提取是否合格。
3、第一步：获取CEBPB的转录本序列。首先打开生物医学之家并进入NCBI，搜索CEBPB，进入其详细介绍页面，找到转录本序列，其中NM_005194是最短且与其他转录本交集的序列，适用于后续引物设计。第二步：设计引物。使用Snapgene软件打开NM_005194转录本的序列，进行多序列比对，选择并复制共同序列用于引物设计。
4、以RT-qPCR为例，进行实验设计时，首先提取三个样本的RNA并逆转录得到cDNA，再计算熔解曲线、Ct值和模板的稀释倍数等信息。为简化说明，以下仅以A、B、C、D四个基因的相对表达量为例进行演示。实验前准备阶段包括提取RNA、逆转录cDNA等步骤。
5、准备PCR反应混合物：准备qPCR反应混合物，包括模板DNA或cDNA、引物primers和荧光探针等。PCR扩增：将反应混合物置于热循环仪Thermal Cycler中，通过多个温度阶段的循环反应，使目标序列在DNA聚合酶的催化下进行逐渐扩增。
6、qPCR实验的全方位准备与操作指南在进行qPCR实验时，前期准备至关重要。首先，确保实验设备的精准性，如移液枪和qPCR仪需定期校准。引物的设计和验证是关键步骤，目标是选择扩增效率在90%~110%、融解曲线单一峰的引物，以保证高效扩增和特异性。